ПЦР диагностика туберкулеза у детей и взрослых: показания к проведению

Всемирная организация здравоохранения 20 лет назад признала, что скорость распространения туберкулеза вышла из-под контроля и достигла масштаба эпидемии. С тех пор ситуация не улучшилась. Ежегодно диагностируется более миллиона случаев заболевания, из них почти четверть заканчивается летально. В последнее десятилетие увеличилась частота заболеваемости среди детей, большинство форм болезни не поддаются стандартной антибиотикотерапии.

На сегодня одной из глобальных задач для медицины является разработка таких методов диагностики, которые позволят выявлять патологию до появления ярко выраженной клинической симптоматики. Одним из них является полимеразная цепная реакция (ПЦР) на туберкулез, которая помогает обнаружить болезнетворные палочки Коха в крови, мокроте и других биологических жидкостях.

Диагностика туберкулеза

Скрининговые обследования направлены на обнаружение больных, носителей туберкулеза и предотвращение распространения инфекции в обществе. Для детей в возрасте младше 14 лет массово используется проба Манту. Это иммунологический тест, при котором подкожно вводится доза туберкулина – сложная смесь генетического материала нескольких видов микобактерий. Появление ярко выраженной реакции свидетельствует об активно протекающем инфекционном процессе.

Для профилактического осмотра у взрослых используют флюорографию или рентген. Эти методы помогают визуализировать патологические очаги в ткани легких. Однако вызывает трудности дифференцирования туберкулеза с другой органической патологией (злокачественные и доброкачественные новообразования, воспалительные процессы, паразитарные инвазии, профессиональное поражение легких).

Для уточнения структуры и размеров патологического очага могут понадобиться дополнительные инструментальные исследования:

• прицельная рентгенография;
• компьютерная томография;
• магнитно-резонансная томография.

В случае сомнительных результатов и для назначения адекватной терапии возникает потребность в более точных методах диагностики, которые позволяют выделить возбудителя. Для подтверждения легочных форм туберкулеза в течение длительного времени используют микроскопическое и бактериологическое исследование мокроты.

В последние годы участилось количество случаев поражения микобактерией различных органов и систем – почек, костей, кишечника, кожи. Для выявления этих форм туберкулеза могут быть использованы ультразвуковые исследования, посев мочи и кала, эндоскопические исследования.

ПЦР диагностика при туберкулезе поможет подтвердить наличие палочки Коха в крови, а также ее чувствительность к определенным препаратам. Это высокоэффективный метод, основанный на обнаружении генетического материала бактерии в различных биологических жидкостях.

Специфика и показания

Полимеразная цепная реакция – высокочувствительный микробиологический метод диагностики, основой которого являются принципы генной инженерии. Для подтверждения наличия возбудителя в биологическом материале достаточно обнаружить уникальный для него фрагмент нуклеиновой кислоты. Метод ПЦР на туберкулез может выявить бактерию в крови, мокроте, моче.

На данный момент разработано несколько методик проведения анализа. Среди них наиболее популярны следующие:

• ПЦР в режиме реального времени;
• микрофлюидные технологии;
• секвенирование и пиросеквенирование.

В лабораториях наиболее часто используют полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени так, как она сокращает количество ложноположительных результатов, а сам процесс проведения анализа занимает короткое время.

Учитывая большое количество скрытых форм заболевания и неэффективности стандартных методов диагностики, все чаще используют ПЦР. Назначение этого анализа показано при:

• выявлении подозрительных участков на рентгеновском снимке;
• сомнительных результатах туберкулиновой пробы;
• невозможности проведения микроскопического и бактериологического анализа мокроты у лиц в тяжелом состоянии;
• проведении оперативных вмешательств, когда необходимо быстро убедиться в отсутствии заражения;
• недопустимости использования флюорографии, рентгена или компьютерной томографии (например, у беременных и кормящих грудью, в случаях превышения лучевой нагрузки);
• подозрении на внелегочные формы туберкулеза (при этом рекомендовано использовать не только кровь, но и мокроту).

ПЦР диагностика туберкулеза хорошо зарекомендовала себя при обследовании детей, в связи с отсутствием дополнительного облучения и быстрого результата.

Подготовка и порядок проведения анализа

Специальной подготовки для сдачи ПЦР крови не требуется. Однако во избежание осложнений забора крови и с целью получения качественного материала следует придерживаться следующих общих правил:

• анализ нужно сдавать утром не ранее, чем через 2 часа после пробуждения;
• следует ограничить прием жирной и жареной пищи за сутки до забора крови;
• воздержаться от приема еды, чая и кофе за 8-9 часов, разрешается выпить чистой воды;
• не курить минимум 3-4 часа.

В случае постоянного приема медикаментов (гормоны, антикоагулянты, противовоспалительные средства, антибиотики, препараты для разжижения крови) следует предупредить об этом лаборанта.

При сдаче мокроты следует хорошо почистить зубы, несколько раз прополоскать полость рта. Собрать материал в стерильный контейнер. Для лучшего результата с вечера можно принять отхаркивающее или муколитическое средство.

Сама диагностика состоит из нескольких этапов.

• Забор материала. Может выполняться в лаборатории и удаленно. Некоторые виды материала пациент собирает самостоятельно (моча, мокрота).

• Разрушение структуры нуклеиновых кислот (денатурация молекул ДНК и РНК). Для этого исследуемый материал нагревают до температуры 98 градусов и выдерживают несколько минут. В результате этого двойная спираль раскручивается, образовываются одноцепочечные молекулы.

  

  Схема ПЦР

• Отжиг. После добавления праймера (короткого участка нуклеиновой кислоты), температура снижается на несколько градусов, активируется полимераза.
• Элогнация. Температуру доводят до оптимального уровня, активность фермента достигает максимума и происходит достраивание второй цепи в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.

Для завершения исследования нужно синтезировать необходимое количество молекул ДНК – около 50 циклов вышеописанной реакции. Это занимает около 2-3 часов. Положительный результат реакции не всегда говорит об активной стадии заболевания, а является показателем наличия микроорганизма в организме.

Преимущества и недостатки метода

В сравнении с другими микробиологическими методами, на выявление микобактерий туберкулеза с помощью ПЦР не требуется длительного времени, результата можно получить в день сдачи анализа.

Также преимуществом является высокая специфичность анализа, что позволяет выявить наличие возбудителя с точностью 90-95% практически в любом биоматериале (кровь, моча, кал, спинномозговая жидкость, мокрота, смыв из бронхов).

Однако существует ряд недостатков метода:

• довольно высокий процент ложноположительных результатов (до 15%), что связано с выявлением неживых микроорганизмов;
• в некоторых случаях можно пропустить факт заболевания, так как микобактерия туберкулеза часто подвергается мутациям и ее генетический материал изменяется;
• низкая эффективность при обследовании людей с иммунодефицитами;
• высокая стоимость исследования, необходимость наличия дорогостоящего оборудования и реактивов.

Чем можно заменить?

Учитывая разнообразие форм туберкулезной инфекции, для более точной постановки диагноза и выбора тактики лечения необходимо сочетать несколько диагностических исследований:

• Обязательным анализом для детей является проба Манту. Если при введении туберкулина (генетический материал микобактерий) возникает ярко выраженная реакция, то можно предполагать инфицирование туберкулезной палочкой.

• Для визуализации патологического очага могут быть использованы рентгенографические методы. При диагностике внелегочных форм туберкулеза используют эндоскопические методы с одновременной биопсией:

  • бронхоскопия помогает выявить поражение гортани, трахеи, бронхов;
  • колоноскопия – кишечник;
  • цистоуретроскопия – органы мочевыделительной системы;
  • гистероскопия – женские половые органы. Эти методы неспецифичны, для постановки точного диагноза следует выявить возбудителя.

• Общеклинические анализы помогут более конкретно определить состояние организма. Обязательно проводится общий анализ крови с лейкоцитарной формулой.

  Увеличение количества нейтрофилов при сниженном уровне лимфоцитов и повышение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) свидетельствует об активно протекающем воспалительном процессе бактериальной этиологии. Для исключения поражения органов мочевыделительной системы используют общий анализ мочи и посев на стерильность.

Проведение ПЦР на данный момент доступно в большинстве частных лабораторий. Для этого требуются не только высококвалифицированные специалисты, но и дорогостоящее оборудование, большое количество реактивов. Поэтому использование этого метода ограничено вопреки его высокой точности и специфичности.